Der Arzt befragt den Patienten zu den Symptomen und möglichen Vorerkrankungen (Anamnese) und untersucht dann die Afterregion. Dies geschieht durch Betrachtung und durch Abtasten. Oft muss auch eine Mastdarmspiegelung (Rektoskopie) vorgenommen werden. Die Fistel kann auch mit einem dünnen Instrument sondiert werden, oder es wird mittels eines Farbstoffes getestet, ob bestimmte Verbindungen bestehen. Gelegentlich kann es notwendig werden, bildgebende Verfahren wie Ultraschall, Computertomographie (CT) oder Kernspintomographie (MRT) anzuwenden.
Eine Steißbeinfistel (Sinus pilonidalis) ist eine bei manchen Menschen vorhandene Öffnung zwischen Steißbein und Anus, die, wenn sie sich entzündet, Symptome wie eine „herkömmliche" Fistel zeigen kann. Ebenfalls von Analfisteln unterschieden werden muss ein Krankheitsbild namens Akne inversa, bei der es auch an anderen Körperregionen (z. B. Achselhöhle) zu Abszessen und Fisteln kommen kann. Als Ursache für anale Fisteln muss des Weiteren hauptsächlich ein Morbus Crohn, eine der chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen, ausgeschlossen werden.
