Vor der Lumbalpunktion erfolgt oft eine örtliche Betäubung. Zur Gewinnung des Liquors setzt sich der Patient mit gekrümmtem Rücken vor den Arzt oder legt sich auf die Seite. Die Haut über dem Entnahmebereich wird gründlich desinfiziert. Die Nadel wird zwischen zwei Wirbelkörpern der Lendenwirbelsäule eingestochen und so weit hineingeschoben, bis sich das Ende im Wirbelkanal befindet.
Dann tritt die Nervenflüssigkeit tropfenweise aus und kann in einem oder mehreren Probenröhrchen aufgefangen werden. Falls keine weiteren Maßnahmen mehr erfolgen sollen, wird die Punktionsnadel wieder herausgezogen und die Stichstelle mit einem sterilen Verband abgedeckt. Die Liquorprobe wird in ein Labor geschickt, in dem es auf die verschiedenen Parameter untersucht wird.